Use este identificador para citar ou linkar para este item:
http://hdl.handle.net/11612/3782| Autor(a): | Barros, Evandro Do Nascimento |
| Orientador: | Barreto, Horllys Gomes |
| Título: | Avaliação de métodos para a extração de RNA do vírus da dengue |
| Palavras-chave: | Flavivírus;RT-qPCR;Diagnóstico Molecular |
| Data do documento: | 2021 |
| Editor: | Universidade Federal do Tocantins |
| Citação: | Barros, Evandro Do Nascimento. Avaliação de métodos para a extração de RNA do vírus da dengue. 28 f. Monografia (Graduação). Curso de Medicina. Universidade Federal do Tocantins. Palmas, 2021. |
| Resumo: | O vírus da dengue (DENV) é uma das principais arboviroses responsáveis por uma doença que se assemelha clinicamente à infecção causada por outros vírus, como zika e Chikungunya, principalmente, na fase inicial dos sintomas, no entanto pode avançar para quadros graves como a febre hemorrágica da dengue (FHD). Diante disso, torna-se importante a realização de testes laboratoriais para auxiliar no diagnóstico da doença. Entre os métodos disponíveis, a RT-qPCR é um método rápido, sensível e altamente específico, que identifica qualquer sorotipo do vírus da dengue, por meio da amplificação do material genético, mas apresenta um alto custo para a sua realização e necessita de um RNA de qualidade para a sua execução. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivos avaliar métodos de extração de RNA e analisar qual deles teria a melhor relação custo/benefício. Foram utilizadas 15 amostras de soro de pacientes com a infecção causada pelo vírus da dengue, com 1(um) ml cada uma. Foram comparados três kits comerciais (QIAamp, Biogene e Biopur). Avaliaram-se a quantidade e a qualidade do RNA extraído com os três métodos estudados, por meio do uso do equipamento Nanodrop® One Espectrophotometer. O kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) foi utilizado, para converter o RNA viral em cDNA, e a detecção foi realizada, por meio do equipamento 7500 fast real-time pcr system (Applied Biosystems), em triplicatas técnicas, por meio do uso do kit Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher). Todos os métodos permitiram a obtenção de uma concentração média de RNA maior que 100 ng/μl. As relações de pureza A260/A230 e A260/A280 ficaram com valores mais altos que os recomendados, o que provavelmente foi causado pela adição de carreadores de RNA. Em todas as amostras, o vírus da dengue (sorotipo 2) foi detectado, indicando que todos os kits permitiram a extração de RNA viral a partir de amostras de soro. Ao comparar os valores do ciclo de quantificação (Cq) de cada amostra, observou-se que o kit QIAamp teve a melhor sensibilidade entre os kits comerciais. Entretanto, ao comparar os custos de cada metodologia utilizada, o kit QIAamp teve o maior valor por amostra, sendo 64,3% e 80,2% mais caro que os kits Biopur e BioGene, respectivamente. Contudo, os métodos avaliados podem ser utilizados para a extração de RNA do vírus da dengue a partir de amostras de soro. O método QIAamp permitiu a obtenção de valores de Cqs via RT-qPCR, menores que os outros métodos avaliados, o que pode indicar maior sensibilidade na detecção do alvo, no entanto o método BioGene apresentou a melhor relação custo-benefício |
| Abstract: | Dengue virus (DENV) is one of the main arboviruses, being responsible for a disease that clinically resembles the infection caused by other viruses, such as Zika and Chikungunya, especially during the onset of symptoms, however it can progress to severe stages like the dengue hemorrhagic fever (DHF). Therefore, it is important to carry out laboratory tests to aid in the disease diagnosis. Among the available diagnostic tests, RT-qPCR is a fast, sensitive, and highly specific method, which identifies any DENV serotype through the amplification of its genetic material, though it is expensive and requires high-quality RNA to be performed. In this context, this study aimed to evaluate different RNA extraction methods and analyze which one have the best cost/benefit ratio. Fifteen serum samples, with 1 ml each, from patients with the infection caused by the dengue virus, were used. Three commercial kits (QIAamp, Biogene and Biopur) were compared. The extracted RNA obtained from the three methods under analysis had its quality and quantity assessed by a Nanodrop® One Espectrophotometer. The High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems) was used to convert the viral RNA into cDNA, and DENV detection was performed using the 7500 fast real-time PCR system (Applied Biosystems), using technical triplicates and the Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) kit. All methods generated an average RNA concentration greater than 100 ng/μl. The A260/A230 and A260/A280 purity ratios were higher than those recommended, what was probably caused by the addition of carrier RNA. The DENV (serotype 2) was detected in all samples, indicating that all tested kits allowed the isolation of viral RNA from the serum samples. The comparison of the cycle of quantification (Cq) values from each sample showed that the QIAamp kit displayed the best sensitivity among the tested kits. However, when comparing the cost from each methodology used, the QIAamp kit had the highest cost per sample, being 64.3% and 80.2% more expensive than the Biopur and BioGene kits, respectively. Thus, all tested methods can be used for the isolation DENV from serum samples. The QIAmp method allowed the generation of lower Cqs values on the RT-qPCR analysis, when compared to the other RNA isolation methods, suggesting that it may present a higher sensitivity on the target detection, however, the BioGene method showed a best cost/benefit ratio. |
| URI: | http://hdl.handle.net/11612/3782 |
| Aparece nas coleções: | Medicina |
Arquivos associados a este item:
| Arquivo | Descrição | Tamanho | Formato | |
|---|---|---|---|---|
| Monografia EVANDRO DO NASCIMENTO BARROS.pdf | 593.38 kB | Adobe PDF |  Visualizar/Abrir |
Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.